北京大学周专教授团队发现可卡因调控神经调质的分泌机理 | Cell Press对话科学家
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2022年8月16日，北京大学未来技术学院周专团队联合首都医科大学徐志卿团队、俄亥俄州立大学顾好钢团队以及深圳湾实验室/北京大学深圳研究生院张勃团队合作，在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell Reports发表了题为“Cocaine increases quantal norepinephrine secretion through NET-dependent PKC activation in locus coeruleus neurons”的研究论文，该研究揭示了可卡因增强大脑中神经递质分泌的分子机理，并提示蓝斑核团的去甲肾上腺素分泌参与调控可卡因药物诱导的小鼠兴奋行为。
周专教授与徐志卿教授、顾好钢教授、张勃研究员为本文的共同通讯作者，北京大学博士后祝飞鹏、首都医科大学刘丽娜工程师和北京大学博士生李杰为本文共同第一作者。
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药物成瘾是机体反复与药物接触引起的一类复发性脑病，其主要特点是强迫性药物使用、持续性渴求状态和对药物渴求控制力的减弱，严重损害了人类的身心健康并危害社会安全。可卡因是使用最广的毒品之一，通过激活脑神经奖赏系统，产生欣快感，引起脑组织损伤和病变，导致成瘾。此前认为可卡因提高脑神经调质水平，源于阻断细胞外“神经调质”（儿茶酚胺单胺类神经递质，包括多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素NE）的再吸收。但可卡因是否调节“神经调质”的分泌，是一个未知难题。
这个难题主要受限于检测方法。现有神经分泌检测，包括儿茶酚胺荧光探针，不能在单个囊泡水平上区分递质分泌和递质回收。针对儿茶酚胺，基于电化学原理，使用我们改良后的高灵敏度微碳纤电极能分辨出单囊泡的“量子化”分泌过程（Zhou Z, PNAS,1995；Huang, PNAS,2007；Wang, Nat. Commun.,2014）。
为回答可卡因是否调控单个囊泡的分泌这一基础和重要的问题，本文采用高灵敏微碳纤电极检测（记录）“量子化”神经递质囊泡分泌方法，从而检测可卡因是否直接调控NE分泌和/或回收。通过使用电生理-电化学联合记录的方式检测刺激细胞诱发的量子化NE分泌，发现可卡因直接增强蓝斑神经元NE的分泌。通过制备可卡因特异结合位点突变的NE转运体（NET）转基因小鼠，确定了介导可卡因调控NE分泌的作用靶点NET和细胞内信号分子PKC。进一步的研究揭示可卡因对蓝斑神经元NE分泌的调控最终会抑制蓝斑神经元的兴奋性以及可卡因诱发的小鼠兴奋行为。蓝斑脑区是大脑中主要的NE能神经元核团，参与调节睡眠觉醒、学习记忆、情绪等生理行为，而本文的结果提示蓝斑-NE神经元也参与调控可卡因药物成瘾。这项动物研究提示了成瘾药物可卡因的一个新的作用靶点和致瘾机理。
A.蓝斑神经元胞体NE量子化释放，可卡因增加NE释放频次。B.示意图展示可卡因通过增加蓝斑神经元胞体NE分泌来抑制自身神经元电活动，从而调控小鼠兴奋行为。
该研究获得了北大清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、国家重点研发项目、北京市科委、美国NIH、深港脑科学创新研究院的经费支持。该研究得到了北京大学生命科学学院电镜中心的技术支持。
作者专访
Cell Press细胞出版社公众号特别邀请周专教授代表研究团队接受了专访，请他为大家进一步详细解读。
CellPress：
大脑中单胺类神经调质是成瘾药物的主要作用对象，神经调质的改变会有什么后果，影响哪些生理行为呢？
周专教授：
单胺类神经调质是脑中重要的神经递质，它们与负责突触信号传导的神经递质不同，主要是调控神经元或者神经突触的结构和功能。成瘾药物包括可卡因主要作用在神经调质，如多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺。吸食可卡因会使脑中单胺类神经调质的浓度上升，高浓度的神经调质与其相应的受体结合（大部分神经调质的受体为GPCR），进而引发神经元的活性、神经突触传导的改变。长期的用药会造成神经元发生长久的结构和功能改变，导致多脑区的病变。由于神经调质的分布范围很广，因此影响的生理行为也是多种的，研究比较多的是奖赏行为、情绪、记忆、进食等。
CellPress：
单胺类神经调质的分泌与谷氨酸、GABA等神经递质分泌相比具有哪些特征？
周专教授：
单胺类神经调质和谷氨酸、γ-氨基丁酸神经递质都是存储在囊泡里，在胞内钙离子的促进下以囊泡的形式分泌。当然它们有很多不同的地方。1）谷氨酸、γ-氨基丁酸主要存储在突触的小清囊泡中，而单胺类神经调质的囊泡种类既有小囊泡也有致密大囊泡，并且囊泡不仅分布于轴突末梢也会分布在神经元胞体、树突。2）分泌的时程不同。谷氨酸、γ-氨基丁酸神经递质分泌很快，在接收刺激后的几个毫秒内就会大量释放；而单胺类神经调质的释放会有延迟，甚至在胞体区释放延迟会达到秒级。3）由于神经调质的受体大部分都不是离子通道，因此检测分泌的方法与谷氨酸、γ-氨基丁酸不同。目前单胺类神经调质的分泌检测方法有高效液相色谱、电化学、同位素、荧光成像等。
CellPress：
NET既介导NE的转运回收，也介导NE的分泌，怎么理解它的双向功能呢？
周专教授：
这对于我们来说也是非常意外的一个发现。NE转运体是一个十二次跨膜的转运蛋白，通过消耗ATP能量来实现对胞外NE分子的转运，几乎没有报导参与启动信号通路。然而本文发现将NET与可卡因结合的位点突变，可卡因对NE分泌的调控就会消除，说明NET是可卡因促进分泌的结合靶点。并且实验结果显示可卡因促进分泌过程是需要激活细胞内的PKC活性，因此NET下游是PKC。但关于NET如何激活PKC，是间接还是直接作用？目前这还是一个黑盒子。关于DA转运体能与其他信号蛋白直接作用的工作给我们带来一些启示，比如NET也能与一些信号蛋白分子有直接作用，当配体（如可卡因）与之结合时引发的结构变化可能会激活与其结合的信号蛋白，从而实现对分泌的调控？这需要在未来的研究中进一步探索验证。
CellPress：
尽管本文检测的是去甲肾上腺素系统，您认为可卡因对多巴胺、血清素等神经调质的分泌是否也有类似的调控作用？
周专教授：
是的。尽管我们的研究只看了去甲肾上腺素系统，但基于单胺类神经调质系统的分泌具有很多相似性，单胺类的转运体去甲肾上腺素转运体（NET）、多巴胺转运体（DAT）和5-羟色胺转运体（SERT）属于同一转运体家族，结构上具有高度同源性，因此我们猜测本研究发现的现象也可能适用于多巴胺和5-羟色胺分泌。
CellPress：
您认为本文的研究对临床药物成瘾治疗有什么指导意义？
周专教授：
本文研究揭示可卡因作用机制具有多样性，即除了抑制NE的转运回收，还能直接调控NE分泌。NE的转运回收过程与分泌过程是完全不同的两条信号通路，其中的分子机理也不同，所以我们的研究提供了新的分子信号通路。从先有分泌再有转运回收的角度来说，研究可卡因对分泌的调控在效果上可能大于对转运回收的调控。其二，我们的实验结果提示蓝斑-NE神经元参与调控可卡因诱发的小鼠兴奋行为，这为后续针对NE系统的临床药物开发提供了实验依据。
作者介绍
周专
教授
周专，北京大学未来技术学院教授，北大-清华生命科学联合中心PI
研究兴趣、领域：周专课题组主要研究细胞分泌发生机理，细胞分泌和内吞的动力学，细胞离子通道、受体和动作电位，以及细胞分泌对神经、内分泌、心血管系统功能的贡献。课题组使用膜片钳、细胞膜电容、电化学微碳纤电极、细胞内[Ca2+]i荧光测量、共聚焦荧光FM成像、多光子荧光显微成像等技术，在单个细胞、新鲜组织薄片或活体动物上进行电生理、电化学实时记录。
相关论文信息
论文原文刊载于CellPress细胞出版社旗下期刊Cell Reports上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文
▌论文标题：
Cocaine increases quantal norepinephrine secretion through NET-dependent PKC activation in locus coeruleus neurons
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)01016-6
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111199
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